Dari hasil analisis kimia yang dilakukan sekitar empat puluh tahun kemudian ditemukan bahwa asam nukleat ada dua macam, yaitu asam deoksiribonukleat atau deoxyribonucleic acid (DNA) dan asam ribonukleat atau ribonucleic acid (RNA). Pada tahun 1924 studi mikroskopis menunjukkan bahwa DNA terdapat di dalam kromosom, yang waktu itu telah diketahui sebagai organel pembawa gen (materi genetik). Akan tetapi, selain DNA di dalam kromosom juga terdapat protein sehingga muncul perbedaan pendapat mengenai hakekat materi genetik, DNA atau protein.
Dugaan DNA sebagai materi genetik secara tidak langsung sebenarnya dapat dibuktikan dari kenyataan bahwa hampir semua sel somatis pada spesies tertentu mempunyai kandungan DNA yang selalu tetap, sedangkan kandungan RNA dan proteinnya berbeda-beda antara satu sel dan sel yang lain. Di samping itu, nukleus hasil meiosis baik pada tumbuhan maupun hewan mempunyai kandungan DNA separuh kandungan DNA di dalam nukleus sel somatisnya.
Meskipun demikian, dalam kurun waktu yang cukup lama fakta semacam itu tidak cukup kuat untuk meyakinkan bahwa DNA adalah materi genetik. Hal ini terutama karena dari hasil analisis kimia secara kasar terlihat kurangnya variasi kimia pada molekul DNA. Di sisi lain, protein dengan variasi kimia yang tinggi sangat memenuhi syarat sebagai materi genetik. Oleh karena itu, selama bertahun-tahun protein lebih diyakini sebagai materi genetik, sementara DNA hanya merupakan kerangka struktur kromosom. Namun, pada pertengahan tahun 1940-an terbukti bahwa justru DNA-lah yang merupakan materi genetik pada sebagian besar organisme.
DNA sebagai Materi Genetik
Ada dua bukti percobaan yang menunjukkan bahwa DNA adalah materi genetik. Masing-masing akan diuraikan berikut ini.
Percobaan transformasi
F. Griffith pada tahun 1928 melakukan percobaan infeksi bakteri pneumokokus (Streptococcus pneumonia) pada mencit. Bakteri penyebab penyakit pneumonia ini dapat menyintesis kapsul polisakarida yang akan melindunginya dari mekanisme pertahanan tubuh hewan yang terinfeksi sehingga bersifat virulen (menimbulkan penyakit). Jika ditumbuhkan pada medium padat, bakteri pneumokokus akan membentuk koloni dengan kenampakan halus mengkilap. Sementara itu, ada pula strain mutan pneumokokus yang kehilangan kemampuan untuk menyintesis kapsul polisakarida sehingga menjadi tidak tahan terhadap sistem kekebalan tubuh hewan inangnya, dan akibatnya tidak bersifat virulen. Strain mutan ini akan membentuk koloni dengan kenampakan kasar apabila ditumbuhkan pada medium padat. Pneumokokus yang virulen sering dilambangkan dengan S, sedangkan strain mutannya yang tidak virulen dilambangkan dengan R.
Mencit yang diinfeksi dengan pneumokokus S akan mengalami kematian, dan dari organ paru-parunya dapat diisolasi strain S tersebut. Sebaliknya, mencit yang diinfeksi dengan strain R dapat bertahan hidup. Demikian juga, mencit yang diinfeksi dengan strain S yang sebelumnya telah dipanaskan terlebih dahulu akan dapat bertahan hidup. Hasil yang mengundang pertanyaan adalah ketika mencit diinfeksi dengan campuran antara strain S yang telah dipanaskan dan strain R yang masih hidup. Ternyata dengan perlakuan ini mencit mengalami kematian, dan dari organ paru-parunya dapat diisolasi strain S yang masih hidup.
Dengan hasil tersebut Griffith menyimpulkan bahwa telah terjadi perubahan (transformasi) sifat strain R menjadi S. Transformasi terjadi karena ada sesuatu yang dipindahkan dari sel-sel strain S yang telah mati (dipanaskan) ke strain R yang masih hidup sehingga strain R yang semula tidak dapat membentuk kapsul berubah menjadi strain S yang dapat membentuk kapsul dan bersifat virulen.
Percobaan Griffith sedikit pun tidak memberikan bukti tentang materi genetik. Namun, pada tahun 1944 tiga orang peneliti, yakni O. Avery, C. MacLeod, dan M. McCarty melakukan percobaan untuk mengetahui hakekat materi yang dipindahkan dari strain S ke strain R.
Mereka melakukan percobaan transformasi secara in vitro, yaitu dengan menambahkan ekstrak DNA dari strain S yang telah mati kepada strain R yang ditumbuhkan di medium padat. Di dalam ekstrak DNA ini terdapat juga sejumlah protein kontaminan, dan penambahan tersebut ternyata menyebabkan strain R berubah menjadi S seperti pada percobaan Griffith. Jika pada percobaan Avery dan kawan-kawannya itu ditambahkan enzim RNase (pemecah RNA) atau enzim protease (pemecah protein), transformasi tetap berjalan atau strain R berubah juga menjadi S. Akan tetapi, jika enzim yang diberikan adalah DNase (pemecah DNA), maka transformasi tidak terjadi. Artinya, strain R tidak berubah menjadi strain S. Hal ini jelas membuktikan bahwa materi yang bertanggung jawab atas terjadinya transformasi pada bakteri pneumonia, dan ternyata juga pada hampir semua organisme, adalah DNA, bukan RNA atau protein.
kultur strain S
ekstraksi DNA
ekstrak DNA + protein kontaminan
ditambahkan ke kultur strain R
protease RNase DNase
kultur kultur kultur
strain R strain R strain R
strain R + S strain R + S strain R
Gambar 9.1. Diagram percobaan transformasi yang
membuktikan DNA sebagai materi genetik
Percobaan infeksi bakteriofag
Percobaan lain yang membuktikan bahwa DNA adalah materi genetik dilaporkan pada tahun 1952 oleh A. Hershey dan M. Chase. Percobaan dilakukan dengan mengamati reproduksi bakteriofag (virus yang menyerang bakteri) T2 di dalam sel bakteri inangnya, yaitu Escherichia coli. Sebelumnya, cara berlangsungnya infeksi T2 pada E. coli telah diketahui (lihat Bab XII). Mula-mula partikel T2 melekatkan ujung ekornya pada dinding sel E. coli, diikuti oleh masuknya materi genetik T2 ke dalam sel E. coli sehingga memungkinkan terjadinya penggandaan partikel T2 di dalam sel inangnya itu. Ketika hasil penggandaan partikel T2 telah mencapai jumlah yang sangat besar, sel E. coli akan mengalami lisis. Akhirnya, partikel-partikel T2 yang keluar akan mencari sel inang yang baru, dan siklus reproduksi tadi akan terulang kembali.
Bakteriofag T2 diketahui mempunyai kandungan protein dan DNA dalam jumlah yang lebih kurang sama. Untuk memastikan sifat kimia materi genetik yang dimasukkan ke dalam sel inang dilakukan pelabelan terhadap molekul protein dan DNAnya. Protein, yang umumnya banyak mengandung sulfur tetapi tidak mengandung fosfor dilabeli dengan radioisotop 35S. Sebaliknya, DNA yang sangat banyak mengandung fosfor tetapi tidak mengandung sulfur dilabeli dengan radioisotop 32P.
materi genetik masuk
dilabeli dengan 35S dan 32P ke sel inang
|
sel inang lisis
|
Gambar 9.2. Daur hidup bakteriofag T2 dan diagram percobaan infeksi T2 pada E. coli yang membuktikan DNA sebagai materi genetik
Bakteriofag T2 dengan protein yang telah dilabeli diinfeksikan pada E. coli. Dengan sentrifugasi, sel-sel E. coli ini kemudian dipisahkan dari partikel-partikel T2 yang sudah tidak melekat lagi pada dinding selnya. Ternyata di dalam sel-sel E. coli sangat sedikit ditemukan radioisotop 35S, sedangkan pada partikel-partikel T2 masih banyak didapatkan radioisotop tersebut. Apabila dengan cara yang sama digunakan bakteriofag T2 yang dilabeli DNAnya, maka di dalam sel-sel E. coli ditemukan banyak sekali radiosiotop 32P, sedangkan pada partikel-partikel T2 hanya ada sedikit sekali radioisotop tersebut. Hasil percobaan ini jelas menunjukkan bahwa materi genetik yang dimasukkan oleh bakteriofag T2 ke dalam sel E. coli adalah materi yang dilabeli dengan 32P atau DNA, bukannya protein.
RNA sebagai Materi Genetik pada Beberapa Virus
Beberapa virus tertentu diketahui tidak mempunyai DNA, tetapi hanya tersusun dari RNA dan protein. Untuk memastikan di antara kedua makromolekul tersebut yang berperan sebagai materi genetik, antara lain telah dilakukan percobaan rekonstitusi yang dilaporkan oleh H. Fraenkel-Conrat dan B. Singer pada tahun 1957.
Mereka melakukan penelitian pada virus mozaik tembakau atau tobacco mozaic virus (TMV), yaitu virus yang menyebabkan timbulnya penyakit mozaik pada daun tembakau. Virus ini mengandung molekul RNA yang terbungkus di dalam selubung protein. Dengan perlakuan kimia tertentu molekul RNA dapat dipisahkan dari selubung proteinnya untuk kemudian digabungkan (direkonstitusi) dengan selubung protein dari strain TMV yang lain.
protein
RNA
pemisahan rekonstitusi infeksi ke daun
RNA dari tembakau
protein
Gambar 9.3. Percobaan yang membuktikan RNA sebagai materi genetik pada TMV
= TMV strain A = TMV strain B
RNA dari strain A direkonstitusi dengan protein strain B. Sebaliknya, RNA dari strain B direkonstitusi dengan protein dari strain A. Kedua TMV hasil rekonstitusi ini kemudian diinfeksikan ke inangnya (daun tembakau) agar mengalami penggandaan. TMV hasil penggandaan ternyata merupakan strain A jika RNAnya berasal dari strain A dan merupakan strain B jika RNAnya berasal dari strain B. Jadi, faktor yang menentukan strain hasil penggandaan adalah RNA, bukan protein. Oleh karena itu, dapat disimpulkan bahwa materi genetik pada virus-virus yang tidak mempunyai DNA, seperti halnya TMV, adalah RNA.
Komposisi Kimia Asam Nukleat
Hasil analisis kimia asam nukleat menunjukkan bahwa makromolekul ini tersusun dari subunit-subunit berulang (monomer) yang disebut nukleotida sehingga asam nukleat dapat juga dikatakan sebagai polinukleotida. Nukleotida yang satu dengan nukleotida berikutnya dihubungkan oleh ikatan fosfodiester yang sangat kuat. Tiap nukleotida terdiri atas tiga komponen, yaitu gugus fosfat, gula pentosa (gula dengan lima atom karbon), dan basa nukleotida atau basa nitrogen (basa siklik yang mengandung nitrogen). Pada DNA basa nitrogen berikatan secara kimia dengan gula pentosa membentuk molekul yang disebut nukleosida sehingga setiap nukleotida pada DNA dapat disebut juga sebagai nukleosida monofosfat.
Gula pentosa pada DNA adalah 2-deoksiribosa, sedangkan pada RNA adalah ribosa. Menurut kebiasaan, penomoran atom C pada gula pentosa dilakukan menggunakan tanda aksen (’) untuk membedakannya dengan penomoran atom C pada basa nitrogen. Atom C pada gula pentosa yang berikatan dengan basa nitrogen ditentukan sebagai atom C pertama (1’). Atom C nomor 2’ pada DNA tidak mengikat gugus OH seperti halnya pada RNA, tetapi mengikat gugus H sehingga gula pentosanya dinamakan deoksiribosa.
Sementara tu, basa nitrogen ada dua macam, yakni basa dengan cincin rangkap atau disebut purin dan basa dengan cincin tunggal atau disebut pirimidin. Basa purin, baik pada DNA maupun RNA, dapat berupa adenin (A) atau guanin (G), sedangkan basa pirimidin pada DNA dapat berupa sitosin (C) atau timin (T). Pada RNA tidak terdapat basa timin, tetapi diganti dengan urasil (U).
Biasanya DNA mempunyai struktur sebagai molekul polinukleotida untai ganda, sedangkan RNA adalah polinukleotida untai tunggal. Ini merupakan perbedaan lain di antara kedua macam asam nukleat tersebut.
O
O P = O gugus fosfat
O
5’CH2OH O 5’CH2OH O
OH OH
4’ 1’ 4’ 1’
H H H H H H H H
3’ 2’ 3’ 2’
OH H OH OH
gula 2-deoksiribosa gula ribosa
NH2 O
N N
N 6 5 7 8 H H N 6 5 7 8 H
1 1
H 2 4 9 NH2 2 4 9
3 N H 3 N H
N N
adenin guanin
NH2 O O
4 4 4
N3 5 H H N3 5 CH3 H N3 5 H
2 1 6 H 2 1 6 H 2 1 6 H
O NH O NH O NH
sitosin timin urasil
Gambar 9.4. Komponen kimia asam nukleat
Model Struktur DNA Watson-Crick
Model struktur fisik molekul DNA pertama kali diajukan pada tahun 1953 oleh J.D. Watson dan F.H.C. Crick. Ada dua dasar yang digunakan dalam melakukan deduksi terhadap model tersebut, yaitu
- Hasil analisis kimia yang dilakukan oleh E. Chargaff terhadap kandungan basa nitrogen molekul DNA dari berbagai organisme selalu menunjukkan bahwa konsentrasi adenin sama dengan timin, sedangkan guanin sama dengan sitosin. Dengan sendirinya, konsentrasi basa purin total menjadi sama dengan konsentrasi basa pirimidin total. Akan tetapi, nisbah konsentrasi adenin + timin terhadap konsentrasi guanin + sitosin sangat bervariasi dari spesies ke spesies.
- Pola difraksi yang diperoleh dari hasil pemotretan molekul DNA menggunakan sinar X oleh M.H.F. Wilkins, R. Franklin, dan para koleganya menunjukkan bahwa basa-basa nitrogen tersusun vertikal di sepanjang sumbu molekul dengan interval 3,4 Å.
Setiap pasangan basa berjarak 3,4 Å dengan pasangan basa berikutnya. Di dalam satu kali pilinan (360°) terdapat 10 pasangan basa. Antara basa A dan T yang berpasangan terdapat ikatan hidrogen rangkap dua, sedangkan antara basa G dan C yang berpasangan terdapat ikatan hidrogen rangkap tiga. Hal ini menyebabkan nisbah A+T terhadap G+C mempengaruhi stabilitas molekul DNA. Makin tinggi nisbah tersebut, makin rendah stabilitas molekul DNAnya, dan begitu pula sebaliknya.
Gugus fosfat dan gula terletak di sebelah luar sumbu. Seperti telah disebutkan di atas, nukleotida-nukleotida yang berurutan dihubungkan oleh ikatan fosfodiester. Ikatan ini menghubungkan atom C nomor 3’ dengan atom C nomor 5’ pada gula deoksiribosa. Di salah satu ujung untai polinukleotida, atom C nomor 3’ tidak lagi dihubungkan oleh ikatan fosfodiester dengan nukleotida berikutnya, tetapi akan mengikat gugus OH. Oleh karena itu, ujung ini dinamakan ujung 3’ atau ujung OH. Di ujung lainnya atom C nomor 5’ akan mengikat gugus fosfat sehingga ujung ini dinamakan ujung 5’ atau ujung P. Kedudukan antiparalel di antara kedua untai polinukleotida sebenarnya dilihat dari ujung-ujung ini. Jika untai yang satu mempunyai arah dari ujung 5’ ke 3’, maka untai komplementernya mempunyai arah dari ujung 3’ ke 5’.
OH(3’)
P(5’)
P
P
P
P
P
P
P
P
P(5’)
OH(3’) Gambar 9.5 Diagram struktur molekul DNA
= gula = adenin = timin = guanin = sitosin
Fungsi Materi Genetik
Setelah terbukti bahwa DNA merupakan materi genetik pada sebagian besar organisme, kita akan melihat fungsi yang harus dapat dilaksanakan oleh molekul tersebut sebagai materi genetik. Dalam beberapa dasawarsa pertama semenjak gen dikemukakan sebagai faktor yang diwariskan dari generasi ke generasi, sifat-sifat molekulernya baru sedikit sekali terungkap. Meskipun demikan, ketika itu telah disepakati bahwa gen sebagai materi genetik, yang sekarang ternyata adalah DNA, harus dapat menjalankan tiga fungsi pokok berikut ini.
- Materi genetik harus mampu menyimpan informasi genetik dan dengan tepat dapat meneruskan informasi tersebut dari tetua kepada keturunannya, dari generasi ke generasi. Fungsi ini merupakan fungsi genotipik, yang dilaksanakan melalui replikasi. Bagian setelah ini akan membahas replikasi DNA.
- Materi genetik harus mengatur perkembangan fenotipe organisme. Artinya, materi genetik harus mengarahkan pertumbuhan dan diferensiasi organisme mulai dari zigot hingga individu dewasa. Fungsi ini merupakan fungsi fenotipik, yang dilaksanakan melalui ekspresi gen (Bab X).
- Materi genetik sewaktu-waktu harus dapat mengalami perubahan sehingga organisme yang bersangkutan akan mampu beradaptasi dengan kondisi lingkungan yang berubah. Tanpa perubahan semacam ini, evolusi tidak akan pernah berlangsung. Fungsi ini merupakan fungsi evolusioner, yang dilaksanakan melalui peristiwa mutasi (Bab XI).
Ada tiga cara teoretis replikasi DNA yang pernah diusulkan, yaitu konservatif, semikonservatif, dan dispersif. Pada replikasi konservatif seluruh tangga berpilin DNA awal tetap dipertahankan dan akan mengarahkan pembentukan tangga berpilin baru. Pada replikasi semikonservatif tangga berpilin mengalami pembukaan terlebih dahulu sehingga kedua untai polinukleotida akan saling terpisah. Namun, masing-masing untai ini tetap dipertahankan dan akan bertindak sebagai cetakan (template) bagi pembentukan untai polinukleotida baru. Sementara itu, pada replikasi dispersif kedua untai polinukleotida mengalami fragmentasi di sejumlah tempat. Kemudian, fragmen-fragmen polinukleotida yang terbentuk akan menjadi cetakan bagi fragmen nukleotida baru sehingga fragmen lama dan baru akan dijumpai berselang-seling di dalam tangga berpilin yang baru.
konservatif semikonservatif dispersif
Gambar 9.6. Tiga cara teoretis replikasi DNA
= untai lama = untai baru
Di antara ketiga cara replikasi DNA yang diusulkan tersebut, hanya cara semikonservatif yang dapat dibuktikan kebenarannya melalui percobaan yang dikenal dengan nama sentrifugasi seimbang dalam tingkat kerapatan atau equilibrium density-gradient centrifugation. Percobaan ini dilaporkan hasilnya pada tahun 1958 oleh M.S. Meselson dan F.W. Stahl.
Mereka menumbuhkan bakteri Escherichia coli selama beberapa generasi di dalam medium yang mengandung isotop nitrogen 15N untuk menggantikan isotop nitrogen normal 14N yang lebih ringan. Akibatnya, basa-basa nitrogen pada molekul DNA sel-sel bakteri tersebut akan memiliki 15N yang berat. Molekul DNA dengan basa nitrogen yang mengandung 15N mempunyai tingkat kerapatan (berat per satuan volume) yang lebih tinggi daripada DNA normal (14N). Oleh karena molekul-molekul dengan tingkat kerapatan yang berbeda dapat dipisahkan dengan cara sentrifugasi tersebut di atas, maka Meselson dan Stahl dapat mengikuti perubahan tingkat kerapatan DNA sel-sel bakteri E. coli yang semula ditumbuhkan pada medium 15N selama beberapa generasi, kemudian dikembalikan ke medium normal 14N selama beberapa generasi berikutnya.
Molekul DNA mempunyai kerapatan yang lebih kurang sama dengan kerapatan larutan garam yang sangat pekat seperti larutan 6M CsCl (sesium khlorida). Sebagai perbandingan, kerapatan DNA E.coli dengan basa nitrogen yang mengandung isotop 14N dan 15N masing-masing adalah 1,708 g/cm3 dan 1,724 g/cm3, sedangkan kerapatan larutan 6M CsCl adalah 1,700 g/cm3.
Ketika larutan 6M CsCl yang di dalamnya terdapat molekul DNA disentrifugasi dengan kecepatan sangat tinggi, katakanlah 30.000 hingga 50.000 rpm, dalam waktu 48 hingga 72 jam, maka akan terjadi keseimbangan tingkat kerapatan. Hal ini karena molekul-molekul garam tersebut akan mengendap ke dasar tabung sentrifuga akibat adanya gaya sentrifugal, sementara di sisi lain difusi akan menggerakkan molekul-molekul garam kembali ke atas tabung. Molekul DNA dengan tingkat kerapatan tertentu akan menempati kedudukan yang sama dengan kedudukan larutan garam yang tingkat kerapatannya sama dengannya.
DNA yang diekstrak dari sel E. coli yang ditumbuhkan pada medium 15N terlihat menempati dasar tabung. Selanjutnya, DNA yang diekstrak dari sel E.coli yang pertama kali dipindahkan kembali ke medium 14N terlihat menempati bagian tengah tabung. Pada generasi kedua setelah E.coli ditumbuhkan pada medium 14N ternyata DNAnya menempati bagian tengah dan atas tabung. Ketika E.coli telah ditumbuhkan selama beberapa generasi pada medium 14N, DNAnya nampak makin banyak berada di bagian atas tabung, sedangkan DNA yang berada di bagian tengah tabung tetap. Meselson dan Stahl menjelaskan bahwa pada generasi 15N, atau dianggap sebagai generasi 0, DNAnya mempunyai kerapatan tinggi. Kemudian, pada generasi 14N yang pertama, atau disebut sebagai generasi 1, DNAnya merupakan hibrid antara DNA dengan kerapatan tinggi dan rendah. Pada generasi 2 DNA hibridnya masih ada, tetapi muncul pula DNA baru dengan kerapatan rendah. Demikian seterusnya, DNA hibrid akan tetap jumlahnya, sedangkan DNA baru dengan kerapatan rendah akan makin banyak dijumpai. Pada Gambar 9.7 terlihat bahwa interpretasi data hasil percobaan sentrifugasi ini jelas sejalan dengan cara pembentukan molekul DNA melalui replikasi semikonservatif.
medium 15N ekstrak DNA
(generasi 0)
ekstrak DNA
medium 14N (generasi 1)
ekstrak DNA
(generasi 2)
medium 14N
ekstrak DNA
medium 14N (generasi 3)
interpretasi data hasil sentrifugasi DNA
Gambar 9.7. Diagram percobaan Meselson dan Stahl yang memperlihatkan
replikasi DNA secara semikonservatif
Pada percobaan Meselson dan Stahl ekstrak DNA yang diperoleh dari sel-sel E. coli berada dalam keadaan terfragmentasi sehingga replikasi molekul DNA dalam bentuknya yang utuh sebenarnya belum diketahui. Replikasi DNA kromosom dalam keadaan utuh _ yang pada prokariot ternyata berbentuk melingkar atau sirkular _ baru dapat diamati menggunakan teknik autoradiografi dan mikroskopi elektron. Dengan kedua teknik ini terlihat bahwa DNA berbagai virus, khloroplas, dan mitokhondria melakukan replikasi yang dikenal sebagai replikasi θ (theta) karena autoradiogramnya menghasilkan gambaran seperti huruf Yunani tersebut. Selain replikasi θ, pada sejumlah bakteri dan organisme eukariot dikenal pula replikasi yang dinamakan replikasi lingkaran menggulung (rolling circle replication). Replikasi ini diawali dengan pemotongan ikatan fosfodiester pada daerah tertentu yang menghasilkan ujung 3’ dan ujung 5’. Pembentukan (sintesis) untai DNA baru terjadi dengan penambahan deoksinukleotida pada ujung 3’ yang diikuti oleh pelepasan ujung 5’ dari lingkaran molekul DNA. Sejalan dengan berlangsungnya replikasi di seputar lingkaran DNA, ujung 5’ akan makin terlepas dari lingkaran tersebut sehingga membentuk ’ekor’ yang makin memanjang (Gambar 9.8).
penambahan
nukleotida
ujung 3’
tempat ujung 5’ pelepasan ujung 5’ pemanjangan ’ekor’
terpotongnya ikatan fosfodiester
Gambar 9.8. Replikasi lingkaran menggulung
= untai lama = untai baru
Dimulainya (inisiasi) replikasi DNA terjadi di suatu tempat tertentu di dalam lingkaran molekul DNA yang dinamakan titik awal replikasi atau origin of replication (ori). Proses inisiasi ini ditandai oleh saling memisahnya kedua untai DNA, yang masing-masing akan berperan sebagai cetakan bagi pembentukan untai DNA baru sehingga akan diperoleh suatu gambaran yang disebut sebagai garpu replikasi. Biasanya, inisiasi replikasi DNA, baik pada prokariot maupun eukariot, terjadi dua arah (bidireksional). Dalam hal ini dua garpu replikasi akan bergerak melebar dari ori menuju dua arah yang berlawanan. Pada eukariot, selain terjadi replikasi dua arah, ori dapat ditemukan di beberapa tempat.
Enzim-enzim yang berperan dalam replikasi DNA
Replikasi DNA, atau sintesis DNA, melibatkan sejumlah reaksi kimia yang diatur oleh beberapa enzim. Salah satu diantaranya adalah enzim DNA polimerase, yang mengatur pembentukan ikatan fosfodiester antara dua nukleotida yang berdekatan sehingga akan terjadi pemanjangan untai DNA (polinukleotida).
Agar DNA polimerase dapat bekerja mengatalisis reaksi sintesis DNA, diperlukan tiga komponen reaksi, yaitu
- Deoksinukleosida trifosfat, yang terdiri atas deoksiadenosin trifosfat (dATP), deoksiguanosin trifosfat (dGTP), deoksisitidin trifosfat (dCTP), dan deoksitimidin trifosfat (dTTP). Keempat molekul ini berfungsi sebagai sumber basa nukleotida.
- Untai DNA yang akan digunakan sebagai cetakan (template).
- Segmen asam nukleat pendek, dapat berupa DNA atau RNA, yang mempunyai gugus 3’- OH bebas. Molekul yang dinamakan primer ini diperlukan karena tidak ada enzim DNA polimerase yang diketahui mampu melakukan inisiasi sintesis DNA.
T G T C . . . . . DNA cetakan T G T C . . . . . .
A C A A C A G
dGTP PPi
3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’
P P P OH DNA polimerase P P P P OH
5’ 5’ 5’ Mg2+ 5’ 5’ 5’ 5’
Gambar 9.9. Skema reaksi sintesis DNA
Enzim DNA polimerase yang diperlukan untuk sintesis DNA pada E. coli ada dua macam, yaitu DNA polimerase I (Pol I) dan DNA polimerase III (Pol III). Dalam sintesis DNA, Pol III merupakan enzim replikasi yang utama, sedangkan enzim Pol I memegang peran sekunder. Sementara itu, enzim DNA polimerase untuk sintesis DNA kromosom pada eukariot disebut polimerase α.
Selain mampu melakukan pemanjangan atau polimerisasi DNA, sebagian besar enzim DNA polimerase mempunyai aktivitas nuklease, yaitu pembuangan molekul nukleotida dari untai polinukleotida. Aktivitas nuklease dapat dibedakan menjadi (1) eksonuklease atau pembuangan nukleotida dari ujung polinukleotida dan (2) endonuklease atau pemotongan ikatan fosfodiester di dalam untai polinukleotida.
Enzim Pol I dan Pol III dari E. coli mempunyai aktivitas eksonuklease yang hanya bekerja pada ujung 3’. Artinya, pemotongan terjadi dari ujung 3’ ke arah ujung 5’. Hal ini bermanfaat untuk memperbaiki kesalahan sintesis DNA atau kesalahan penambahan basa, yang bisa saja terjadi meskipun sangat jarang (sekitar satu di antara sejuta basa !). Kesalahan penambahan basa pada untai polinukleotida yang sedang tumbuh (dipolimerisasi) menjadikan basa-basa salah berpasangan, misalnya A dengan C. Fungsi perbaikan kesalahan yang dijalankan oleh enzim Pol I dan III tersebut dinamakan fungsi penyuntingan (proofreading). Khusus enzim Pol I ternyata juga mempunyai aktivitas eksonuklease 5’→ 3’ di samping aktivitas eksonuklease 3’→5’ (lihat juga Bab XI).
Enzim lain yang berperan dalam proses sintesis DNA adalah primase. Enzim ini bekerja pada tahap inisiasi dengan cara mengatur pembentukan molekul primer di daerah ori. Setelah primer terbentuk barulah DNA polimerase melakukan elongasi atau pemanjangan untai DNA.
Tahap inisiasi sintesis DNA juga melibatkan enzim DNA girase dan protein yang mendestabilkan pilinan (helix destabilizing protein). Kedua enzim ini berperan dalam pembukaan pilinan di antara kedua untai DNA sehingga kedua untai tersebut dapat saling memisah.
Pada bagian berikut ini akan dijelaskan bahwa sintesis DNA baru tidak hanya terjadi pada salah satu untai DNA, tetapi pada kedua-duanya. Hanya saja sintesis DNA pada salah satu untai berlangsung tidak kontinyu sehingga menghasilkan fragmen yang terputus-putus. Untuk menyambung fragmen-fragmen ini diperlukan enzim yang disebut DNA ligase.
Replikasi pada kedua untai DNA
Proses replikasi DNA yang kita bicarakan di atas sebenarnya barulah proses yang terjadi pada salah satu untai DNA. Untai DNA tersebut sering dinamakan untai pengarah (leading strand). Sintesis DNA baru pada untai pengarah ini berlangsung secara kontinyu dari ujung 5’ ke ujung 3’ atau bergerak di sepanjang untai pengarah dari ujung 3’ ke ujung 5’.
Pada untai DNA pasangannya ternyata juga terjadi sintesis DNA baru dari ujung 5’ ke ujung 3’ atau bergerak di sepanjang untai DNA cetakannya ini dari ujung 3’ ke ujung 5’. Namun, sintesis DNA pada untai yang satu ini tidak berjalan kontinyu sehingga menghasilkan fragmen terputus-putus, yang masing-masing mempunyai arah 5’→ 3’. Terjadinya sintesis DNA yang tidak kontinyu sebenarnya disebabkan oleh sifat enzim DNA polimerase yang hanya dapat menyintesis DNA dari arah 5’ ke 3’ serta ketidakmampuannya untuk melakukan inisiasi sintesis DNA.
Untai DNA yang menjadi cetakan bagi sintesis DNA tidak kontinyu itu disebut untai tertinggal (lagging strand). Sementara itu, fragmen-fragmen DNA yang dihasilkan dari sintesis yang tidak kontinyu dinamakan fragmen Okazaki, sesuai dengan nama penemunya. Seperti telah dikemukakan di atas, fragmen-fragmen Okazaki akan disatukan menjadi sebuah untai DNA yang utuh dengan bantuan enzim DNA ligase.
ori untai tertinggal
5’ 3’ 5’ 3’ 5’
3’ fragmen-fragmen 3’ 5’
3’ 5’ Okazaki
5’ 3’ 5’ 3’
untai baru kontinyu
untai pengarah
Gambar 9.10. Diagram replikasi pada kedua untai DNA
Tidak ada komentar:
Posting Komentar